Аграрію важливо раціонально використовувати пестициди та агрохімікати для збереження власного врожаюПерепади температури негативно вплинули на майбутню врожайність пізніх ярих культурЗворотній зв’язок із фермером: Група компаній UKRAVIT взяла активну участь у Днях поля по всій території УкраїниРинок м'яса в першому півріччі продемонстрував зростанняЯк обрати оптимальний протруйник?ТОП-7 фактів про сільське господарство ШвейцаріїКомпанія DuPont Pioneer Україна представила результати агрономічних дослідів кукурудзиСтрахування озимих культур від осінньої посухи – додаткова гарантія стабільностіІталія на смак: ТОП-6 найкращих фермерських ринківПравда про садівництво: як створити прибутковий бізнес?Без агрострахування неможливо отримати доступ до кредитування Як найкраще підготувати землю до весняної посівної Угорський досвід для українського АПК ДПЗКУ вже заготовила 2,5 млн тонн збіжжя з початку 2016/2017 МР Генетика як рушій прогресу Як обрати надійного страхового партнера 

CRISPR-Cas як передовий метод селекції рослин

AgroNews190407.jpg

Технологія CRISPR-Cas як передове знаряддя селекції рослин є дуже багатообіцяючоюі потужною. Вона може полегшити точну селекцію через розвиток природних характеристик, які вже є в культурі через процес, який зараз часто називають «редагування геному». DuPont Pioneer  є світовим лідером в застосуванні CRISPR-Cas для передової селекції в рослинництві і зараз створює свій перший продукт на основі CRISPR-Cas – нове покоління восковидної кукурудзи, яке буде продуктом-піонером в сільському господарстві, розробленим за допомогою цієї новітньої технології.

Протягом більш як 90-річної історії Pioneer був лідером просування підвищеної продуктивності в сільському господарстві через покращення культур. Компанія, заснована в 1926, очолила революцію в селекції кукурудзи, яка за допомогою гібридизації дозволила істотно збільшити урожаї. З впровадженням в сільському господарстві в 1990-их роках методів біотехнології, компанія показала, що бажані ознаки зі сторонніх джерел можуть бути привнесені в сорт чи гібрид. Наприклад, інтродукція ознаки Bt з ґрунтової бактерії дає кукурудзі можливість самій захищатися від шкідників, таким чином покращуючи урожай кількісно і якісно.

CRISPR-Cas має численний потенціал сільськогосподарського застосування, що включає покращення урожайності, стійкість до хвороб, толерантність до посухи та зовнішні характеристики.

Зараз прориви в галузі редагування геному підводять нас до третьої революції в покращенні рослин, що буде використовуватися як доповнення до існуючих технологій. Редагування геному – це процес внесення точних цільових змін в нитку ДНК, зроблену з послідовностей з чотирьох базових нуклеотидів (цитозину, гуаніну, аденіну і тиміну), які входять до складу генів та інших геномних ознак і визначають характеристики і різноманітність рослин. В той час, як поточне застосування CRISPR-Cas все ще є складним, за своєю концепцією воно подібне до редагування документа за допомогою текстового процесора.  В цій аналогії інструмент CRISPR-Cas є курсором, який можна встановити в потрібному місці речення. Позиціонування цього курсора робить можливим видаляти, міняти або вставляти літери або навіть слова в вибране місце і покращувати, таким чином, текст. В такий самий спосіб за допомогою CRISPR-Cas можна виділяти наявні в рослині генетичні послідовності і вносити зміни, забезпечуючи бажані характеристики. Очікується, що ця революційна технологія допоможе вченим у створенні іновативних і екологічно раціональних рішень для фермерів, подібних до тих, які досягаються традиційними методами селекції, але ще кращої якості, точності та часової ефективності.

У справі редагування геному CRISPR-Cas є одним із найбільш захопливих методів, який був дуже швидко пристосований завдяки таким перевагам над іншими методами як: якість, ефективність та технічна гнучкість. CRISPR-Cas має величезний потенціал застосування, який виходить далеко за межі сільського господарства, і в останні кілька років привернув до себе значну увагу світових ЗМІ після того, як кількість досліджень в цьому напрямку буквально вибухнула (Рис. 1).

 

Рисунок 1. Наукові публікації в PubMed пов’язані з CRISPR за період з 2005 по 2016 рр. (згідно 12-9-16, www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed).

Pioneer є лідером з CRISPR-Cas в сільському господарстві і оголосив наміри запропонувати на ринку перший комерційний продукт, створений з використанням CRISPR-Cas вже за 5 років, після польових досліджень та відповідних регуляторних оглядів. Pioneer використовує цю технологію для пришвидшення приходу нової ери покращення рослин. 

Історія CRISPR-Cas

Вперше дослідження, яке пізніше стане відомим як CRISPR-Cas, було оприлюднене в 1987 році вченими з Японії, які вивчали ділянки геному E. coli. Вони ідентифікували присутність п’яти ідентичних послідовностей ДНК-повторів, відділених неповторюваними послідовностями ДНК одного й того самого розміру. В той момент на це звернули увагу як на курйоз, але залишили без пояснень (Ishino et al., 1987). Що більше геномів секвенували, то більше знаходили таких повторюваних ознак у бактерій, включаючи бактерії, які приймають участь у виробництві йогурту та сиру, та бактерій, які живуть в кишках людини. Загадковості додавало те, що ці повторення регулярних інтервалів супроводжувалися тими самими групами генів. Повторювані ділянки було врешті-решт названо «CRISPR», скороченням від «короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами», а супутні гени отримали назву «Cas», скорочено від «асоційовані з CRISPR» або «CRISPR-associated genes» (Jansen et al., 2002). Нарешті було усвідомлено, що послідовності між повторами мають риси, спільні з вірусами, які інфікують ці бактерії подібно до записів про імунізацію, та що деякі з генів, асоційованих з Cas, кодують білкові області, пов’язані з розрізанням ДНК.

На той час вже було добре відомо, що для розрізання ДНК бактеріофагів (вірусів, які інфікують бактерії) бактерії використовують білки. Тож відразу з’явилася гіпотеза, що CRISPR був свого роду послідовністю, асимільованою з геному вірусів-окупантів в спейсерні послідовності і протеїни Cas для вирізання ДНК інфікуючих вірусів. Команда дослідників компанії Danisco (придбаною DuPont в 2011 році) на чолі з Філіпом Хорватом (Phillippe Horvath) надала перший біологічний факт, що CRISPR-Cas складає в бактерії імунну противірусну систему. Дослідження, проведене його командою, показало, що штами бактерій йогурту Streptococcus thermophilus, які пережили вірусну інфекцію, мали вбудовані в своїх CRISPR-локусах послідовності з геному вірусів, які їх вражали. Після цього ці штами бактерій Streptococcus thermophilus ставали стійкими до наступних інфікувань цим вірусом (Barrangou et al., 2007). Цей прорив ґрунтувався на попередній роботі Хорвата та колег в ранні 2000-ні, які спочатку застосовували CRISPR для бактеріальної ідентифікації, потім - як можливість покращити стійкість початкової культури штамів проти атаки бактеріофагів.

З роками було ідентифіковано численні системи CRISPR-Cas з індивідуальними характеристиками. З цього ряду виділяється одна з серій відкриттів періоду між 2011 та 2012 роками, яка і висунула системи CRISPR-Cas на передній фронт революції в редагуванні геному. Згідно з цим відкриттям три складники цієї системи характеризуються як необхідні і достатні, щоб специфічно зчитати і розрізати ДНК, молекулу, яка утворює геном і кодує інструкції життя (Рис. 2.).

Рисунок 2. Ілюстрація природної роботи системи CRISPR. Вірусні ДНК-послідовності вбудовуються в масиви CRISPR бактерій, які потім продукують crRNA комплементарні до чужорідної ДНК-ділянки. crRNA гібридизуються до tracrRNAs і зв’язуються з протеїном Cas9. Комбінований комплекс розпізнає і вирізає чужорідну ДНК, яка відповідає послідовності раніше інкорпорованій в масив CRISPR бактерії.

Першим складником є білок, який називають Cas9 – білок, закодований геном Cas9. Додатково до механізму розрізання молекули ДНК він також розпізнає дуже короткий відрізок поблизу послідовності ДНК, яка відповідає за ініціацію процесу зчитування ДНК. Другим складником є РНК (споріднена з ДНК), яка походить з локуса CRISPR, що містить послідовність, яка встановлює послідовність ДНК, яку потрібно розрізати. Ця РНК відома як CRISPR РНК (crРНК) і відповідає за зв’язування цільової ДНК. Третім складником є друга РНК (відома як tracrРНК), яка також походить з локуса CRISPR і служить зв’язкою для асоціювання послідовності crРНК з білком Cas9 (Deltcheva et al., 2011). 

У 2012 році кілька наукових журналів опублікували звіти про те, що цих трьох складників достатньо для зчитування і розрізання ДНК, і що crРНК можна змінити так, щоб вона розпізнавала практично будь-яку послідовність ДНК з будь-якого організму. Щоб спростити систему і покращити її ефективність, було визначено, що crРНК  і tracrРНК  можуть бути скомбіновані в просту РНК (Рис. 2). Ця легко програмована двохкомпонентна система Cas9 керована РНК є на сьогодні інструментом CRISPR-Cas, який найбільш широко використовується всіма галузями біологічних наук (Jinek et al., 2012; Mali et al., 2013).

CRISPR-Cas полегшує вдосконалення рослин

Білок CRISPR-Cas, Cas9, полегшує редагування геному, функціонуючи як точні і програмовані молекулярні ножиці, які розрізають ДНК у визначеному місці.  Після розрізування цільової послідовності ДНК система CRISPR-Cas за допомогою природних клітинних механізмів відновлення ДНК видаляє, редагує або вставляє гени.

Багатоклітинні організми, включаючи рослини, постійно стикаються з розривами ДНК, викликаними зовнішніми чинниками, такими як сонячне світло, а також внутрішніми процесами, такими як вивільнення вільних молекулярних радикалів. Щоб вижити, ці організми виробили ефективні механізми відновлення численних ДНК-розривів, які стаються в кожній клітині кожного дня. Відновлення ДНК можна класифікувати двома шляхами: 1) негомологічні з’єднання кінців та 2) гомологічні рекомбінації  (Рис. 3).

Рисунок 3. CRISPR-Cas полегшує відновлення ДНК. Відновлення без шаблону відбувається через негомологічне з’єднання кінців (NHEJ) і може бути використане для руйнування функції гену, ефективно видаляючи її. Відновлення з використанням шаблону через гомологічну рекомбінацію (HDR) уможливлює точну заміну і вставку в геном послідовності з ДНК-шаблону.

Негомологічні з’єднання кінців (скорочено NHEJ) є домінуючим способом відновлення ДНК у рослин. Вони не використовують шаблон ДНК для процесу відновлення і просто ідентифікують два розірваних кінці ДНК та вставляють їх назад. Цей процес відновлення ДНК може часто приводити до вставлення або видалення випадкових послідовностей ДНК в місці відновлення. Якщо розірвана ДНК-послідовність представляє ген рослини, функція цього гена порушується і видаляється.

Гомологічні рекомбінації (часто їх позначають як  HDR) потребують другу нерозірвану нитку ДНК, яка містить послідовність ідентичну до розірваної частини, а також бажану зміну (редагування, специфічна і цільова заміна послідовності або додатковий генетичний матеріал для вставлення). Вони використовують нерозірвану ДНК-нитку як шаблон для відновлення ДНК.

Видалення генів

За допомогою Cas9 можна видаляти потрібні гени, вирізаючи їх з геному. Відновлення способом NHEJ можна використовувати або для того, щоб розірвати послідовність ДНК, яка кодує гени, або у випадку двох розрізів по бокам гена, щоб повністю видалити ген. Прикладом застосування такого способу є наступне покоління восковидних гібридів Pioneer.

Керована селекція

CRISPR-Cas робить можливим пряму передачу ознак між членами одного виду, наприклад різними інбредами кукурудзи. Гомологічної рекомбінації можна досягнути в цільовому інбреді кукурудзи, використовуючи шаблон відновлення, що походить з послідовності ДНК, яка нас цікавить в іншому інбреді. Це – пряма цільова передача потрібної ознаки кукурудзи (наприклад, стійкість до стресу), і завдяки CRISPR-Cas, на відміну від традиційної селекції, передається тільки ця ознака з більшою ефективністю та без «доважок» у вигляді додаткового генетичного матеріалу від інбреда-джерела. Завдяки досвіду Pioneer у передаванні ознак напряму в елітні інбреди, селекційна точність, асоційована з цим процесом, дає змогу інтродукувати ознаки напряму в найновіші елітні інбреди з меншим негативним впливом (наприклад, зниженням урожаю) від процесу інтрогресії (Рис. 4).

Рисунок 4. Порівняння традиційної інтрогресії з керованою селекцією. Традиційна інтрогресія потребує до семи поколінь зворотних схрещувань і все ще несе в собі деяку неелітну генетику. Керована селекція потребує лише два цикли репродукції і містить лише елітну генетику.

Трансгенні ознаки

HDR, полегшений через CRISPR-Cas, можна також використовувати для інтродукції ознак зі сторонніх (не-рідних) джерел (наприклад, трансгени). Здатність CRISPR-Cas зробити це цільовим способом забезпечує значну перевагу над трансгенними методами вставок, які сьогодні використовуються на ринку для створення трансгенних продуктів. CRISPR-Cas можна також використовувати для поєднання кількох трансгенів разом та виокремлення їх в окремий селекційний локус, що, в свою чергу, істотно спрощує процес інтрогресії ознаки.

Сільськогосподарське застосування CRISPR-Cas

Передова селекція

Pioneer створює передову платформу селекції на основі CRISPR-Cas для створення насіннєвих продуктів з потужнішою природною життєздатністю, продуктивністю та екологічністю. CRISPR-Cas має численні потенційні сільськогосподарські застосування, такі як покращення урожайності, стійкість до хвороб та посухи, а також покращення, вигідні для кінцевих споживачів – зовнішній вигляд, поживний вміст тощо.

У нещодавно опублікованих наукових матеріалах вчені Pioneer описують перше застосування CRISPR-Cas для покращення вже присутньої в кукурудзі здатності рослин переживати стрес посухи (Shi et al., 2016). CRISPR-Cas використовувався для визначення гена, ідентифікованого по його природній здатності сприяти посухостійкості. Польові випробування гібридів кукурудзи, які було отримано в результаті, показали в середньому 3,2 ц/га вищий урожай зерна в умовах недостатнього зволоження. Нещодавно було проведено додаткові випробування для визначення комерційного потенціалу в різних умовах середовища. Інші публікації Pioneer, пов’язані з передовою селекцією рослин на основі CRISPR-Cas, включають звіти, які висвітлюють ефективність і гнучкість систем CRISPR-Cas як в кукурудзі (Svitashev et al., 2015; Svitashev et al., 2016), так і в сої (Li et al., 2015).

Покращені гібриди восковидної кукурудзи

Весною 2016 року Pioneer анонсував свій перший комерційний сільськогосподарський продукт, створений за допомогою передової технології селекції CRISPR-Cas – наступне покоління восковидних гібридів (реліз новин Pioneer, 2016). Очікується, що ці гібриди будуть доступними для американських фермерів через п’ять років, після польових випробувань і відповідних регуляторних оглядів.

Вперше описані в ранні 1900-і, восковидні зерна кукурудзи містять >97% амілопектинового крохмалю замість звичних ~75% в традиційній жовтозерній кукурудзі і використовуються для різного роду щоденного харчового і нехарчового споживання (Рис. 5). В Сполучених Штатах вирощується біля 200 тисяч га восковидної кукурудзи. Pioneer є провідним світовим постачальником восковидних гібридів кукурудзи.

Рисунок 5. Восковидна кукурудза, збагачена амілопектином, є бажаним продуктом для харчової, целюлозно-паперової, текстильної та клейової галузей.

Через труднощі та обмеження, пов’язані зі створенням восковидних гібридів методами традиційної селекції, восковидна кукурудза є ідеальним продуктом для імплементації передової селекції рослин на основі CRISPR-Cas. Сьогоднішні восковидні продукти кукурудзи містять частково видалені гени, які відповідають за синтез амілози в ендоспермі. Видалення восковидних генів приводить до порушень в синтезі амілози, і тому майже весь крохмаль такої зернівки складається з амілопектину.  Pioneer вже довгий час займається введенням цієї форми гена в нові елітні інбреди кукурудзи. Проте, цей процес займає багато років і супроводжується «доважкою» у вигляді неелітної генетики. Результатом є те, що восковидні гібриди мають в порівнянні з елітними гібридами меншу врожайність. Використовуючи передову селекцію рослин на основі CRISPR-Cas, восковидний ген можна видалити повністю в найсучасніших елітних інбредах. Таке пряме коригування восковидних характеристик зменшує час, необхідний для створення восковидних гібридів, та дозволяє уникнути зменшення урожайності, пов’язане з інтрогресією ознаки через традиційну селекцію.

Співробітництво з CIMMYT

Восени 2016 року Pioneer та Міжнародний Центр покращення кукурудзи та пшениці (CIMMYT) уклали угоду про спільне створення покращених ліній з використанням редагування геному за допомогою CRISPR-Cas  для задоволення потреб дрібних фермерських господарств у всьому світі. Перший проект дозволить застосувати інструмент CRISPR-Cas для вирішення проблеми летального некрозу кукурудзи (MLN) в Суб-Сахарській (Тропічній) Африці. Вперше зафіксована в Кенії в 2011 році, хвороба поширилася на сусідні країни менш як за п’ять років і зменшила виробництво кукурудзи в середньому на 3% в сухих зонах і на 32% в більш вологих середовищах з втратою до 90% зерна на деяких фермах. В Кенії летальний некроз кукурудзи завдав шкоди близько чверті загального виробництва кукурудзи, з річними втратами близько 52 мільйони доларів США (Mahuku et al., 2015).  Pioneer радий можливості співробітництва з іншими для реалізації повного потенціалу технології передової селекції на базі CRISPR-Cas.

Автори: Jeffry Sander,  Mark Jeschke
переклад:  Сергій Резниченко, керівник відділу маркетингу DuPont Pioneer Україна

За матеріалами: DuPont Pioneer Україна

 

Довідка: Компанія DuPont Pioneer – провідний світовий розробник та постачальник сучасних технологій в галузі генетики рослин, який забезпечує високоякісним насінням сільгоспвиробників в більш ніж 90 країнах світу. Компанія Pioneer надає агрономічну підтримку та супровід з метою підвищення продуктивності і прибутковості аграріїв, а також прагне розвивати системи стійкого ведення сільського господарства у всьому світі.

 

Додати коментар
Содержание этого поля является приватным и не предназначено к показу.
  • Адреса страниц и электронной почты автоматически преобразуются в ссылки.
  • Строки и параграфы переносятся автоматически.

Подробнее о форматировании текста

остані коментарі

Анонси